春雷打野火杜花落 美著名作家 盛的一句： 『眼中所浸染的神，非弱的表，而是力量的制衡。眼著不可逾越的哀， 同也了法言喻的最。』

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卵管::一被外科的MSC新源

使用胞再生性物的可能性已始被搜索,在搜有很大的趣在於得可生多果的胞或由非侵入性步取的的源,我已知MSC可由,牙根及脂肪,些被的物去分化成肌肉,脂肪,骨,骨.

而研究要,大及估人卵管(hFTs)的分化力。

hFTs lineages是大的,有自己的染色型分析.是由flow cytometry以外脂肪形成的,骨形成的,成骨性的.或肌原性的分化。

hFTs是在科手中被的的,也是MSCs的另一富源,也是我所特定的人卵管MSCs(htMSCs)

而在外的中也htMSCs可以容易的分,增生,表出胞的貌且可以在外分形成肌肉,脂肪,骨,及骨.

MSCs具有典型未分化可形成各不同胞的天,具有self-renewal能力,有分化成各不同胞系的力.的各器官有密切的供修的相中都可先胞!然而些功能合成物的胞表面接受器呈,也是MSC不同分出的,,如:骨髓,骨骼肌,肺,脂肪.牙根,胎,!

除了我先前知道的MSCs的源其分化後的器官外.特殊的增生能力在人子膜伴著期,後,手(子刮除,子膜刮除)及停後女以荷蒙治.都暗示MSCs在些的呈位置在程中是有任的!

hFTs在胚胎的源上子具相同功用.它有能力在期分泌的改,包含胞生增生,供特的境是必要的,了持配偶子生存能力.受精.及早期胎展能如同在子那好.研究的目的在於探自Hfts的MSCS的立性增生性,特性及分析其分化力.

方法::

卵管之收集步

在女35-53期,於接受外科手(切除或)前三月使用外的荷蒙治,每本存放於添加10%FBS的DMEM/F-12或DMEM/High.保持在4℃,24小!所有的本以PBS充洗次.以解剖刀切片放入falcon,以TripLE Express在水浴培30分,37℃.然後,取出浮物在15ml的falcon以7mlDMEM/F-12加10%FBS洗一次,以400g心5分.取出沉物接在DMEM/F-12添加其他物,每星期更次!

   PD(Population Doubling)染色型分析

     PD出在最後5天胞系的生速率,以方法算生速

率.由上述步後,以Giemsa染色算染色,以微拍照.

流式胞分析

流式胞使用Guava EasyCyte微管,以射激放射出488-532nm的波的胞,胞以PBS成1.0× 10⁵ cells/Ml,染上抗後置於室下暗室中45分,胞用PBS洗3次,再置入0.25ML的PBS成浮液.

了分析表面呈的典型蛋白makers,附著胞以下列之抗人原始抗

治:: CD13 PE, CD14, CD29-PE-Cy5, CD31-PE, CD34-PerCP, CD38- FITC, CD44-FITC, CD45-FITC, CD73-PE, CD90-R-PE, CD117-PE ,CD133-PE, HLA-ABC-FITC and HLA-DR-R-PE, SSEA4, STRO1, and SH2, SH3 and SH4.未上的Makers到 anti-mouse PE secondary antibody.

MSC分化

估MSC分化的性能,附著胞在外的脂肪形成的,骨形成的,成骨性的或肌原性的分化  程符合以下各章

脂肪性的分化

hFTs的增生胞培在添加1 μM dexamethasone, 500 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 60 μM indomethacin, and 5 μg/mL insulin 的增殖medium.在脂肪形成的分化第21天可得可被oil rde O染上色的富含脂的空泡.

骨性的分化

2.5 × 10⁵ hFTs置於15 mL polystyrene tube以500g心5分,用基medium置成10ml浮液.The basal medium包含 DMEM/High 添加 1% ITS-Premix, 1% 10 mM dexamethasone, 1% 100 mM sodium pyruvate, and 1% 5 mM ascorbic acid-2 phosphate .去除了pellet後,胞以chondrogenic differentiation medium0.5ml回置成浮液, 包含basal medium 添加10 ng/mL TGF- β1 及 10% FBS.保持在37℃,5% CO2的度下.

第一天,慢的倒空以得一的浮胞.每3-4天更一次medium.第21天,胞以10%福林固定24小4℃.埋入石. 切成5 μm薄低切片再以 toluidine blue染色.示胞外母黏多糖.

成骨性的分化

成骨性的分化是hFTs胞培在DMEM/LG;添加 0.1 mM dexamethasone 和 50 mM ascorbic acid-2 phosphate的培基所得. 保持在37℃,5% CO2的度下,第10天, 加入10 mM β-glycerolphosphate促使化,在第21天,成骨化分化以calcium-hydroxyapatite-positive areas型式呈,次PBS及1次蒸水後,胞培於1% silver nitrate於紫外下照射45分.之後培育在3% sodium thiosulfate5分,用Van Gieson染,而聚集示暗色.

肌原性分化

肌原性的分化是hFTs胞培在myogenic differentiation medium (由 50% induction medium 和50% fresh DMEM/F-12 添加 10% FBS 所成保持在37℃,5% CO2的度下.

Proliferation medium, 由 DMEM/F-12 添加10% FBS, 100 IU/mL penicillin和100 IU/mL streptomycin所成,而相同的medium先前被使用於培 primary human myoblasts 48小.使用前 induction medium 先以0.22 μm的膜.而PH值以重碳酸整. hFTs MSCs培40天每星期更次,在隔後,胞以免疫光及西方墨法.

免疫光分析法

免疫光分析法定肌不良蛋白是被用muscle-differentiated hFTs胞的肌原性分化.胞以冷PBS充洗2次, 4% PFA/PBS 20 分4°C固定後,  0.05% Triton X-100加入PBS permeabilized  5分. 10% FBS/PBS在室下行非特性合1小後,添加 primary antibody (anti-dystrophin; Ab15277; Abcam)置於4℃ overnight.然後在加入 secondary antibody (FITC IgG; Chemicon)於室下一小,核仁以染DAPI染色, 我使正常人的differentiated myotubes cultures性照. 使用non-diferentiated htMSCs性照. 用Axiovert 200微查的免疫光染片 .

西方墨法

hFTs 的肌肉分化型蛋白被萃取出後以添加10 mM Tris-HCL [pH 8.0], 150 mM Nacl, 5 mM EDTA, 1% TX-100,和 60 mM octyl glucoside 的液治.

本於13000g心10分去移除不能溶解的物，利用SDS-PAGE 6%分蛋白,移到nitrocellulose membranes上.所有的membranes都染上0.2% Ponceau S估蛋白的量, membranes在室下以TBST加5% MILK,再加入anti-dystrophin (VP-D508)及anti-skeletal myosin (M7523) primary antibodies Overnight .接下, membranes  合peroxidase-conjugated anti-mouse 和 anti-rabbit IgG secondary antibodies在室下一小. 以Enhanced Chemoluminescence Detection System免疫反性的.

.

果

  Lineages Expansion, Population Doubling (PD) and Karyotype analysis

以解法分hFTs後，大部份的形是,似於母胞,一些胞以皮的相貌呈聚集,慢的流.也能被察到.在第一次的酵素分後,5-7天的培期附著胞由含有MSC-like phenotype的同胞成,所有的都增大,冷,解次,PD示高速率的胞分裂.而Karyotype analysis示有常染色.

流式胞

hFTs得的附著胞不表hematopoietic lineage markers (CD34, CD38, CD45, CD117 and CD133), endothelial marker CD31和monocyte marker (CD14).

另外,大部份的胞表高量的adhesion markers (CD29, CD44 and CD90) 和 MSCs markers (CD13, CD73, SH2, SH3 and SH4). hFTs得的立胞可HLA-class I取得,但HLA-class II,了做比,我提供了流式胞在freshly digested and not cultured hFTs.,我使用9mesenchymal stem cells markers (CD13, CD29, CD44, CD73, CD90, Stro-1, SH2, SH3 and SH4),就如同tissue specific markers (CD14, CD31 and CD34).流式胞了hFTs胞的胞貌,由果得知,CD29.CD44.都出在htMSC及freshly digested and not cultured hFTs.

Multilineage Differentiation

hFTs的附著胞其可塑性是在中胚各分化成骨性,脂肪性,骨性三星期後估,多性分化是5的lineages of htMSCs行,而且之分化能力有明的不同,此外,hFTs分化成骨骼肌胞的力在培於medium40天後被考.成肌性分化藉由myogenic markers(myosin和dysprosin)的表示.hFTs於外分化成肌原性, 脂肪性,骨性及成骨性.果信了立胞的胞天性他的多能性.

DISCUSSION

使用胞作增加物的可能性已有一新的搜得最好的MSC源,以非侵略性的步.

初步定如同骨髓的前物,新的表示MSCs出在所有的器官.在保留增生扮演一重要的角色.最近,也在人子膜和血.同在展出增生能力,一最近的研究示isolating stem cell自子膜促外的骨形成.

MSCs已被存在於血,牙根,脂肪,血及生物物,都可以分化成肌肉,脂肪,骨及骨胞系列.些由外科手所的hFTs是含有富MSCs的源,我做htMSCs.早期的htMSCs片段要莫15小的PD.然而,添加其他片段後,PD短且定,且其染色在片段也呈定.

化的 Stro-1-enriched充了移植的抑制作用,而子膜的增生胞(ERC或血胞),是Stro1 negative.另一方面,CD44是在口位置增生石出的MSCs marker, 而在htMSCs及fresh digested fallopian tube tissue都有高度表,CD29，一 integrin.附著胞密切,也在所有htMSCs大量增生.

HtMSCs在孩再生上扮演一重要角色 ,不管如何,高量的adhesion markers (CD29, CD44 and CD90) 及其他 MSC markers (CD13, CD73, SH2, SH3 and SH4) 一起多性分化信了立胞的胞天性他的多能性.

些果也示htMSCs快速大的能力具有在床上用的力.

些卵管上皮胞的型上功能上在受精卵生的微小境及胚胎早期展的演化程扮演相重要的角色.就如同最近人卵管胞在co-culture改良了胚胎型,培植速率,及孕成功!

hFTs以解剖方式得四片段(intramural, isthmic, ampulla, and infundibulum/fimbria)每都包含不同上皮胞,和明的分泌活,菌和病毒常在道被可能零落的入上述的生殖管道分裂hFTs的上皮胞完整,也意味著女性的生殖健康有意的危因子.

我藉由外子膜基胞感骨的分化就能示出endometrial multipotent cells的存在，然而, 使用科的非子膜如myometrium, fallopian tube, and uterosacral ligaments作照,他是不能骨生成的.意味著少的progenitor stem cells在些和子膜相比它在生增生上有低荷,或者分化分析法不用於些.而以我成功得htMSCs上的myogenic, adipogenic, osteogenic,chondrogenic分化基

我假卵管有骨形成的能力,那改相的方法比改progenitor stem cell度的好.

常子切除手後的卵管可能成胞的另一源.
　　巴西保大人基因研究中心的科研人表示:科家已、牙髓和脂肪中找到可以展成肌肉、脂肪、骨骼和骨的胞.些被"生物"的胞源不存在理.卵管正是在手程中留的人碎片.巴西研究人至少近3月未接受激素治的女的卵管行研究,她的年分35-55.卵管中取的胞很容易在分化成其他胞,而且不形成常染色,表明他有良好的染色定性.一可能再生再添一新的胞源.